Категории

Пцр диагностика подготовка

ПЦР-диагностика. Мифы и реальность. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Как подготовиться к сдаче пцр

ПЦР - полимеразная цепная реакция. ПЦР в реальном времени - самый точный и быстрый на данный момент метод микробиологических исследований для выявления различных заболеваний.

Метод ПЦР у мужчин и у женщин способен обнаружить наличие возбудителя инфекции даже в том случае, когда другими методами (бактериологическими, иммунологическими, микроскопическими) может быть ничего не обнаружено.

Суть диагностики заключена в трех основных процедурах:

  • подготовке исследуемой пробы - выделении ДНК или РНК объекта исследований;
  • полимеразной цепной реакции;
  • детекции продукта ПЦР.

Чужеродный генетический материал, являющийся объектом для анализа, в ходе процедуры многократно копируется с помощью ДНК-полимеразы, чтобы потом миллионные количества его копий можно было регистрировать визуально.

Именно это и позволяет ПЦР в реальном времени обнаруживать фрагменты или единичные клетки вирусов и бактерий даже в сложных ситуациях, когда необходимо выявить возбудителя с высокой изменчивостью к антигенам либо паразитирующего внутри клетки, что практически невозможно сделать другими методами.

Какие инфекции можно диагностировать

ПЦР в реальном времени может выявлять возбудителей различных заболеваний. Причем эта методика эффективно определяет и вирусы, и бактерии, и грибки. Как правило, исследование назначают для выявления заболеваний, передающихся половым путем - ПЦР на ЗППП. Регулярно назначают ПЦР на ВИЧ (вирус иммунодефицита человека), ПЦР на ВПЧ (вирус папилломы человека), а также ПЦР на гепатит С и ПЦР на туберкулез.

Нередко это обследование назначают, чтобы выявить инфекции, передаваемые половым путем - ПЦР на ИППП.

Кроме того, метод полимеразной цепной реакции применяется в пренатальных обследованиях, выявляющих «нежелательные» гены плода в утробе матери. Им определяются любые болезни, которые обусловлены особенностями нашего генотипа. Сегодня с помощью ПЦР в реальном времени выявляется более ста заболеваний, закрепившихся в человеческих генах.

Причем, с помощью ПЦР, возбудитель болезни не только выявляется, но и определяется его эффективное лечение. Как сдавать биоматериал для исследования

Данный метод позволяет обнаруживать чужеродные ДНК бактерий и вирусов в различных биологических средах. Материалом исследования для ПЦР у мужчин и женщин могут служить:

  • моча;
  • слизь;
  • кровь;
  • мокрота;
  • эпителиальный соскоб;
  • ткани плаценты.

Вид клинического материала для исследования определяется врачом на основе наиболее вероятного места локализации возбудителя. Для проведения процедуры искусственного оплодотворения одним из условий является ПРЦ в реальном времени на урогенитальные инфекции.

Поэтому для ПЦР на хламидии или ureaplasma, как и для всех остальных инфекций и заболеваний с половым путем передачи, назначают соскоб слизистой половых органов. У женщин на исследование берется содержимое влагалища, а также цервикального канала матки и уретры (для девственниц и беременных). Материалом для ПЦР у мужчин служит соскоб из уретры.

Наиболее адекватным инструментарием взятия соскобов или мазков для анализа считается одноразовый урогенитальный зонд (специальная щеточка), который способен собрать необходимое количество эпителиальной ткани, не травмируя слизистую. Он почти не впитывает отобранный образец и хорошо отдает биоматериал в транспортную среду.

Подготовка к сдаче ПЦР-анализов

Когда ЗППП протекает остро, выявить его не составляет особого труда любым из методов диагностики ИППП. Но в большинстве случаев такие инфекции протекают почти бессимптомно. Поэтому ПЦР в реальном времени зачастую назначается человеку, которого не беспокоит практически ничего. Это и есть, тот случай, когда в организме «в свободном плавании» находится весьма небольшое количество микробов и существует риск, что в лабораторную пробирку не попадет ни один из них и результатом исследования станет: ПЦР не обнаружено.

Чтобы ваши анализы на половые инфекции показали достоверные результаты, перед их сдачей проводят небольшую подготовку. Она абсолютно проста, но повышает точность результатов анализа в разы.

1. Перед сдачей биоматериала для анализов на трое суток воздержитесь от половых контактов. Такого времени достаточно, чтобы инфекционная микрофлора в большом количестве скопились в предстательной железе мужчин и во влагалище женщин.

2. Перед забором материала для ПЦР у мужчин, им не рекомендуют мочиться в течение двух часов до процедуры. Так как вместе с мочой вымывается большая часть бактерий, поэтому мочеиспускание до сдачи биоматериала снижает точность анализа.

3. Накануне анализа ПЦР в реальном времени показано проведение провокации. Провокацию проводят для кратковременного снижения иммунитета, что позволяет добиться усиления воспалительного процесса и увеличения в организме бактерий.

Самым простым и надежным методом является алиментарная провокация, которая включает в себя употребление алкоголя, соленого, острого. Накануне анализа желательно выпить алкоголь и поесть соленой пищи (например, бутылка пива с копченой рыбой). Анализы для ПЦР после такой провокации берут спустя 24, 48, 72 ч. реального времени.

4. Если существует такая возможность: у женщин забор биоматериала для данной диагностики должен проводиться сразу по окончании менструации, когда еще остаются небольшие мажущие выделения. Как правило, это 4 или 5 день цикла.

5. Непосредственно перед процедурой сдачи анализа ПЦР у мужчин и женщин требуют не проводить санацию половых органов с использованием антибактериальных средств.

6. За 10 дней до назначенной процедуры анализа необходимо прекратить принимать любые сильнодействующие лекарственные средства (по согласованию с лечащим врачом). В противном случае, можно получить искаженные результаты ПЦР. Не обнаружено - не лучший итог исследования, если инфекция все же присутствует в организме.

Результаты исследования

Как правило, результат ПЦР-анализов можно забрать через 1,5 или 2 дня после сдачи.

Однако существует и экспресс-диагностика, результаты которой, становятся известны в течение суток либо нескольких часов.

Отрицательный результат анализов, обозначаемый знаком «-», говорит о том, что в результатах ПЦР не обнаружено следов искомой инфекции.

Положительный результат, обозначающийся знаком «+», указывает на выявление в организме искомой инфекции, причем, чем больше таких плюсов (от одного до четырех) присутствует в результатах исследования, тем большее количество инфекционных составляющих было обнаружено.

ПЦР, диагностика, ЗППП, мужское бесплодие, женское бесплодие

Источник: http://www.probirka.org/diagnostika-besplodiya/4574-ptsr-diagnostika-v-protsedure-iskusstvennogo-oplodotvoreniya.html

ПЦР - диагностика в процедуре искусственного оплодотворения

ПЦР (полимеразная цепная реакция) – достижение молекулярной биологии, одна из главных методик клинической лабораторной диагностики конца 20-го и начала 21-го веков, приносящая огромную пользу в различных областях медицинской науки.

Многие люди путают ее с ИФА (иммуноферментный анализ), что, в общем-то, понятно. Они в чем-то схожи, поскольку выполняют одну задачу – поиск причины патологических состояний, обусловленных проникновением в организм человека инфекционных агентов. Однако между ними есть и различия. ИФА, например, ищет следы пребывания микроорганизмов, то есть, антитела (АТ), а ПЦР находит «святая святых» возбудителя – ДНК или РНК (нуклеиновые кислоты), дающих жизнь чуждым человеческому телу микроскопическим существам.

Методам ПЦР доступны нуклеиновые кислоты «врага», находящиеся во всех биологических жидкостях и тканях организма, поэтому данный анализ не обязывает использовать в качестве исследования только венозную кровь, можно взять слюну, выделения из половых путей, мокроту или другую среду, несущую информацию о заболевании. Выбор материала для исследования остается за врачом, который предполагает ту или иную патологию и знает, какая среда в таких случаях более информативна.

В чем суть полимеразной цепной реакции?

ПЦР-исследование – это достижение и огромная заслуга молекулярной биологии. Это — метод, который, обнаружив микроучастки ДНК или РНК  чужеродного генетического материала (генома), способен распознать индивидуальные характеристики, присущие только одному виду микроорганизмов, не спутав его ни с каким другим. Как же работает метод ПЦР и как ему удается восстановить картину поведения инфекционной клетки в живом организме?

процесс проведения ПЦР

Итак, фрагмент нуклеиновой кислоты найден, но он один и для проведения реакции его явно недостаточно, поэтому он кодируется (копирование). Однако для дальнейшего процесса необходимо большое количество таких микроучастков, что может обеспечить его размножение путем достраивания новых, идентичных найденному фрагменту, участков ДНК (репликация). Размножение является естественным и неотъемлемым свойством нуклеиновой кислоты, которая будет реплицироваться с помощью фермента полимеразы даже вне живого организма (в пробирке с пробой), образуя множество клонов, то есть, пойдет цепная реакция. Клонироваться будут все новые и новые фрагменты, но только те, в которых заинтересован исследователь. Вот почему так важно взять «чистый», без посторонних примесей анализ, а тест проводить очень аккуратно.

Учитывая перечисленные способности полимеразной цепной реакции, можно догадаться, почему она так легко отличает уреаплазму от микоплазмы, или каждую из них от хламидии.

Таким образом, даже если среди миллионов клеток человеческого организма затеряется не сам живой вирус, а лишь частица его ДНК, то ПЦР, если ей ничто не помешает, пожалуй, справится с задачей и сообщит о пребывании «чужака» положительным результатом. В этом суть ПЦР и ее основное достоинство.

Достоинства и недостатки

К лаборатории, осуществляющей ПЦР-диагностику, предъявляются высочайшие требования в плане оборудования, тест-систем и квалификации медицинского персонала. Это высокотехнологичная лаборатория, располагающая арсеналом высокочувствительных и высокоспецифичных реагентов, поэтому особых недостатков она не имеет. Разве что выдает положительный результат при отсутствии клинических проявлений и тем самым ставит лечебника перед дилеммой: стоит начинать лечение или нет?

Врач, наблюдающий пациента, начинает сомневаться в достоверности результатов тестирования, поскольку никаких признаков заболевания не видит. Но все же, учитывая высокую чувствительность ПЦР-системы, следует помнить, что она обнаруживает возбудителя даже в доклинической стадии, а положительный результат в таком случае является скорее достоинством, чем недостатком. Исходя из этого, лечащий врач должен сам принять решение о целесообразности терапии, взяв во внимание и другие аргументы «за» и «против».

Преимущества диагностики с помощью полимеразной цепной реакции очевидны:

  • Высокая специфичность, достигающая 100%, обусловленная присутствием в отобранном образце частиц нуклеиновых кислот, присущих конкретному организму, но чужеродных человеку;
  • Высокая производительность, ведь ПЦР – высокотехнологичная автоматизированная методика, предоставляющая возможность проведения тестирования в день забора материала и избавления, таким образом, пациента от лишних треволнений;
  • ПЦР, работая над одной пробой, способна провести несколько исследований и обнаружить несколько возбудителей, если ей будет такое задание. Например, при диагностике хламидийной инфекции, где ПЦР относится к основным методам, наряду с хламидией, можно обнаружить и нейссерию (гонококк) – возбудитель гонореи. Причем, на достоверности результатов это негативно не отражается;
  • Тестирование методом ПЦР выявляет опасные микроорганизмы в инкубационном периоде, когда они еще не успели нанести ощутимый вред организму, то есть, ранняя диагностика предупреждает о грядущем развитии патологического процесса, что дает возможность подготовиться к нему и принять во всеоружии.

Кроме этого, во избежание недоразумений, иной раз возникающих при диагностике, ПЦР защищает себя еще и тем, что ее результаты могут  зафиксироваться (фотография, компьютер) с целью использования их в экспертных целях, если будет на то необходимость.

Нормой в ответах ПЦР считают отрицательный результат, указывающий на отсутствие фрагментов чужеродных нуклеиновых кислот, положительный ответ будет свидетельствовать о наличии инфекции в организме, цифровые значения означают состояние вируса и его концентрацию на момент тестирования. Однако полную расшифровку анализа осуществляет врач, прошедший специальную учебу по теме «ПЦР». Пытаться же интерпретировать результаты самостоятельно не имеет никакого смысла, поскольку можно, что скорее всего и произойдет, неправильно понять и начать заранее волноваться.

Чего «боится» ПЦР, что она умеет и как к ней подготовиться?

Как в любых других исследованиях, иной раз результаты теста оказываются ложноположительными или ложноотрицательными, где ПЦР исключением не является. Подобное может происходить в случаях:

  1. Нарушения технологического процесса на одном из этапов реакции;
  2. Несоблюдения правил забора материала, его хранения или транспортировки;
  3. Присутствие посторонних примесей в материале.

Это говорит о том, что к ПЦР – диагностике инфекций нужно подходить внимательно, осторожно и аккуратно, иначе образцы материала могут поменять свое структурное строение или вовсе разрушиться.

Этапы ПЦР-диагностики. Ложные результаты могут дать нарушения на любом из этапов исследования

ПЦР-диагностика инфекций относится к категории «золотых стандартов» среди других лабораторных методов, поэтому ее можно применить для поиска возбудителей многих заболеваний, на первый взгляд не имеющих ничего общего между собой:

  • Туберкулез различной локализации, пневмония (в том числе и атипичная, вызванная хламидией);
  • Детские инфекции (коревая краснуха, паротит, корь);
  • Дифтерия;
  • Сальмонеллез;
  • Зоонозная инфекционная болезнь – листериоз (заболевание характеризуется многообразием симптомов с поражением лимфоузлов, ЦНС, внутренних органов);
  • Заболевания, обусловленные проникновением вируса Эпштейн-Барра (инфекционный мононуклеоз и др.);
  • Онкологическая патология, спровоцированная папилломовирусной инфекцией (ВПЧ и его типы);
  • Боррелиоз (болезнь Лайма, клещевой энцефалит);
  • Хеликобактерная инфекция, возбудителем которой является проживающий в желудке человека микроб Helicobacter pylori. Доказано, что хеликобактер становится причиной развития рака желудка или 12-перстной кишки;
  • Кандидоз и практически все ЗППП.

ПЦР-диагностика инфекций, передающихся половым путем, имеет особую значимость, поскольку заболевания, вызванные таким образом, часто длительное время протекают без каких бы то ни было клинических проявлений, зато при беременности начинают активизироваться и, таким образом, угрожать здоровью и даже жизни ребенка. Аналогично себя ведут и TORCH- инфекции. Некоторые из них («торч») относятся одновременно и к ИППП, поэтому последние требуют более подробного рассмотрения. Ознакомиться с самыми популярными методиками читатель сможет в следующих разделах статьи.

Как правильно подготовиться, чтобы получить достоверный результат?

Сразу заметим, что подготовка к ПЦР довольно простая, никаких особых усилий со стороны пациента не требующая. Нужно лишь выполнить три несложных задания:

  1. Не иметь половых контактов за 24 часа до того, как сдать анализ;
  2. Для забора и анализа крови из вены нужно прийти на голодный желудок, пить, кстати, тоже нельзя;
  3. Сдать мочу следует ночную (утром – в стерильную баночку, приобретенную накануне в аптеке).

ПЦР может работать в любой биологической среде

Метод ПЦР не отличается «кровожадностью», поэтому приемлет любую биологическую среду, содержащую предполагаемый инфекционный агент.Обычно выбор – что нужно взять для исследования, остается за врачом.

Таким образом, в поисках возбудителя, кроме анализа крови (хотя он тоже подходит и в большинстве случаях берется параллельно другому материалу), можно использовать:

  • Мазок (выделения урогенитального тракта);
  • Соскоб слизистых ротовой полости, конъюнктивы, носоглотки, половых путей (у женщин берут из шейки матки и влагалища, у мужчин – из уретры);
  • Слюну;
  • Сперму;
  • Сок предстательной железы;
  • Ткани плаценты и амниотиотическую жидкость (околоплодные воды);
  • Осадок мочи (после центрифугирования), например, для выявления некоторых ИППП и микобактерий туберкулеза;
  • Мокроту и плевральную жидкость с той же целью;
  • Экссудаты;
  • Спинномозговую жидкость при подозрении на инфекционное поражение ЦНС;
  • Биопсийный материал (биоптат), взятый из печени, 12-перстной кишки, желудка и пр.

К вышеперечисленному хочется добавить, что материала для тестирования во всех случаях, даже в соскобах и выделениях, будет достаточно, так как тестирование методом ПЦР больших объемов не требует, анализу  хватает и нескольких микролитров, которые обычно берут в микропробирку типа «эппендорф» и отправляют на исследование.

Болезни и применение ПЦР

ВИЧ и полимеразная цепная реакция

Обычно при прохождении анонимного обследования в случае положительных результатов иммуноблотинга, диагностику ВИЧ-инфекции повторяют заново. Если диагноз подтверждается, пациенту назначают дополнительные исследования:

  1. Определение с помощью иммунологических реакций абсолютных значений количества лимфоцитов CD4 (иммунокомпетентные клетки – Т-хелперы или помощники), которые инфекция поражает в первую очередь, после чего они теряют свои основные свойства и не могут отличить «свое» и чужое». Циркулирующую в плазме крови РНК вируса они принимают за нормальные клетки организма и не реагируют на них;
  2. Обнаружение РНК вируса методом ПЦР и расчет концентрации вирусных частиц с целью установления стадии, тяжести патологического процесса и прогноза с учетом этих данных. Разумеется, слово «норма» в этом плане не существует, поскольку реакция всегда положительна, а расшифровка цифровых значений находится в компетенции врача.

ПЦР и гепатиты

Методом ПЦР можно выявлять возбудителей гепатитов, чаще всего тест используется для диагностики С гепатита, который плохо определяется другими методами.

Вирус гепатита С (РНК-содержащий) по своему поведению в организме человека напоминает ВИЧ. Вклиниваясь в геном клеток печени (гепатоцитов), он пребывает там в ожидании своего часа, который может наступить хоть через 2 года, хоть через 20 лет, поэтому медики прозвали его «ласковым убийцей». Гепатит С приводит к формированию злокачественного процесса в печеночной паренхиме, который проявляется на поздних стадиях. Все эти события иммунная система не замечает, принимая вирус за гепатоцит. Правда, антитела к вирусу в некоторых количествах вырабатываются, однако они не обеспечивают достойный иммунный ответ. Для диагностики ИФА на гепатит С не очень информативен, поскольку указывает на то, что вирус оставил следы, а ушел ли сам – неизвестно. При ВГС известны случаи самоизлечения, в то время как антитела против вируса остаются и продолжают циркулировать пожизненно (иммунологическая память). ПЦР заметно опережает образование антител и может выявить вирусную частицу уже через 1-1,5 недели, в то время как АТ могут появиться в интервале от 2 месяцев до полугода

ПЦР-диагностика в случае подозрения на разгул вируса гепатита С в организме человека является наиболее оптимальным методом исследования, ибо только она способна распознать присутствие «ласкового врага» в крови или биоптате печени пациента.

Однако иной раз имеют место случаи, когда АТ положительны, а результат ПЦР – отрицательный. Такое иногда происходит при очень низком количестве вируса или при его «дремлющем» состоянии в печени без выхода в кровяное русло. Чтобы все-таки найти истину, у пациента берут повторный анализ, а то и не один.

Папилломовирусная инфекция

ВПЧ (вирус папилломы человека), если не произойдет самоизлечение, тоже может, ничем себя не проявляя, долго персистировать в организме хозяина, который об этом даже не подозревает, поскольку ПЦР сделать не доводилось, а симптомы болезни отсутствовали. Однако наличие папилломовирусной инфекции, пусть и латентной, далеко не безразлично для здоровья человека, где особую опасность несут определенные типы вируса, вызывающие онкологические заболевания (типы 16, 18).

Чаще от ВПЧ страдает женская половина населения, так как вирус больше любит женскую половую сферу, а особенно – шейку матки, где некоторые типы вирусов способствуют развитию диспластических процессов, а затем и рака шейки матки, если не лечить дисплазию и дать волю вирусу. Так вот, полимеразная цепная реакция обнаружит вирусную ДНК, а затем укажет «плохой» или «хороший» (онкогенный или неонкогенный) тип поселился в организме женщины.

Другие ИППП и TORCH-инфекции

Очевидно, что полимеразная цепная реакция может найти любую чужеродную структуру, состоящую из нуклеиновых кислот, поэтому данный тест подходит для выявления всех ЗППП и TORCH-инфекций, тем не менее, он далеко не всегда используется. Зачем, скажем, проводить такие дорогие исследования для обнаружения трихомонады или гонококка, если есть более доступные и дешевые?

TORCH-инфекции и ИППП настолько взаимосвязаны, что, порой, трудно определить, к какой группе следует отнести тот или иной возбудитель. В них вообще бывает сложно разобраться, так как это довольно разнообразные группы микроорганизмов, которые могут передаваться половым путем всегда или только при определенных условиях (иммунодефицит), а могут представлять интерес лишь при беременности, ввиду возможного негативного влияния на ее течение и на плод.

ПЦР – главный метод обнаружения скрытых инфекций

В основе развития клинических проявлений лежат разные возбудители, найти которые бывает под силу только ПЦР, что и является ее основной задачей иногда совместно с ИФА, а иногда в качестве единственного подтверждающего теста, особенно, если симптоматика заболевания отсутствует. Такую непростую ситуацию может создавать полимикробная инфекция, которая, помимо явных возбудителей, включает еще и условно-патогенные.

У мужчин, страдающих воспалительными заболеваниями половой сферы, например, уретритом, часто выявляют хламидию, уреаплазму и микоплазму. Эти же виды несут опасность и женскому организму. Те, кто знает коварство хламидии и сталкивался с ней, наверняка помнят, как тяжело бывает ее найти и распознать, поэтому анализу, произведенному методом ПЦР на хламидии, особенно доверяют, ведь спрятавшийся в клетке очень маленьких размеров паразит ведет себя осторожно, а вред наносит всегда исподтишка.

Уреаплазма зачастую рассматривается в паре с микоплазмой. И это неспроста. Данные виды, как и хламидию, не относят ни к вирусам, ни к бактериям, они проживают внутри клеток и относятся к ИППП, хотя их присутствие в здоровом организме тоже далеко не редкость. Так вот, чтобы отличить здорового носителя от больного человека, нужны особые методы, где ПЦР считается наиболее надежным, поскольку, ввиду особенностей строения и поведения этих микроорганизмов, другие исследования оказываются неэффективными.

Что касается вируса герпеса (тип 1, 2) и цитомегаловируса, который тоже относится к герпесвирусам (тип 5), то здесь тоже ситуация неоднозначная. Инфицированность населения земного шара приближается к 100%, поэтому в данном случае очень важна идентификация вируса и его доза, что особенно играет роль при беременности, ведь взрослому человеку, вирус, прижившийся в его организме, часто не доставляет никаких хлопот и признаков заболевания не дает.

Поэтому не следует игнорировать назначенное врачом подобное обследование, ведь в некоторых случаях полимеразная цепная реакция является обязательным и необходимым методом лабораторной диагностики, способным защитить от серьезных осложнений не только женщину, но и маленького, еще не родившегося, человечка.

В заключение хочется отметить, что такой замечательный метод, как ПЦР, вот уже более 30 лет служит человечеству. При этом, задачи теста не ограничиваются поиском возбудителей инфекционных заболеваний. Полимеразная цепная реакция, рожденная на почве молекулярной биологии, неразрывно связана с генетикой, она успешно применяется в криминалистике для идентификации личности, в судебной медицине для установления отцовства, в ветеринарии, если клиника для животных имеет возможности приобретать дорогое оборудование, а также в других сферах (промышленность, сельское хозяйство и пр.).

Видео: ПЦР — суть и применение

Источник: http://izppp.ru/analizy/pcr/

ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – метод высокой точности в области диагностирования наследственных патологий, инфекций, вирусных болезней в любой стадии (острой или хронической), а также — на раннем этапе — до очевидных проявлений болезни путем идентификации возбудителей, на основе их ДНК, РНК, являющихся генетическим материалом, в пробах, которые получают от пациента. И сегодня мы поговорим про суть, этапы диагностики и принципы методов полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также о ее стоимости.

Что такое полимеразная цепная реакция

Основа анализа — амплификация (удвоение) – создание множества копий из короткого участка ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), представляющей генетический комплекс человека. Для исследования нужно очень малое количество физиологического вещества (мокрота, каловые массы, соскоб эпителия, сок простаты, кровь, сперма, околоплодные воды, слизь, ткань плаценты, моча, слюна, жидкость плевральная, цереброспинальная). При этом, например, в мочеполовом тракте больного возможно обнаружение даже единичного вредоносного микроба.

Методику ПЦР (полимеразной цепной реакции) разработал американский ученый К. Мюллисом, в 1993 получивший Нобелевскую премию.

Активно используется:

  • в раннем диагностировании инфекций, генетических, онкологических патологий;
  • в судебно-медицинской экспертизе при наличии для исследования крайне малого количества ДНК;
  • в ветеринарной медицине, фармацевтике, биологии, молекулярной генетике;
  • для идентификации личности по ДНК, подтверждения отцовства;
  • в палеонтологии, антропологии, экологии (при отслеживании качества продуктов, факторов внешней среды).

О том, что такое полимеразная цепная реакция, расскажет в подробностях данное видео:

Кому ее назначают

Полимеразная цепная реакция в диагностике инфекционных заболеваний — одна из наиболее надежных методик особой точности и достоверности. К примеру, достоверность проведенного анализа ПЦР на хламидии и на многие другие патогены приближается к 100% (абсолютная). Чаще всего процедуру полимеразной цепной реакции назначают пациентам, у которых при диагностировании возникают сложности с идентификацией конкретного возбудителя.

Лабораторный тест ПЦР применяют:

  • для обнаружения болезнетворных организмов, вызывающих инфицирование мочевыводящих и половых органов, трудно идентифицируемых при использовании посевов или методов иммунологии;
  • для повторного диагностирования ВИЧ на начальной стадии в случае положительного, но вызывающего сомнения результата первичного анализа (например, у новорожденных от инфицированных СПИДом родителей);
  • для установления онкологического заболевания на раннем этапе (изучение мутаций онкогенов) и индивидуальной коррекции схемы лечения у конкретного пациента;
  • с целью раннего выявления и потенциального лечения наследственных патологий.

Так, будущие родители сдают анализ, чтобы узнать, являются ли они носителями генетической патологии, у детей ПЦР определяет вероятность подверженности болезни, передающейся по наследству.

  • для обнаружения патологий плода на раннем сроке вынашивания (отдельные клетки растущего эмбриона исследуют на наличие возможных мутаций);
  • у пациентов перед трансплантацией органов – для «тканевого типирования» (определения совместимости тканей);
  • для выявления опасных патогенных организмов в донорской крови;
  • у новорожденных малышей – для выявления скрытых инфекций;
  • для оценки результатов антивирусного и антимикробного лечения.

Зачем проходить такую процедуру

Поскольку ПЦР — высокоэффективный способ диагностики, дающий почти 100% результат, процедуру используют:

  • для подтверждения или исключения окончательного диагноза;
  • быстрой оценки эффективности проводимой терапии.

Во многих случаях ПЦР — единственно возможный тест для обнаружения развивающегося заболевания, если прочие бактериологические, иммунологические и вирусологические методики диагностирования оказываются бесполезными.

  • Вирусы обнаруживаются с помощью процедуры ПЦР сразу после инфицирования и до появления признаков болезни. Раннее выявление вируса позволяет оперативно назначить лечение.
  • Так называемая «вирусная нагрузка» (или — количество вирусов в организме) также определяется при анализе ДНК количественным методом.
  • Конкретные болезнетворные организмы (например, туберкулезную палочку Коха) сложно и слишком долго культивировать. Анализ ПЦР позволяет быстро выявить минимальное количество патогенов (живых и мертвых) в образцах, удобных для исследования.

Подробный анализ ДНК патогена используется:

  • чтобы определить его чувствительность к конкретным видам антибиотиков, что позволяет немедленно приступить к лечению;
  • чтобы контролировать распространение эпидемий среди домашних, диких животных;
  • чтобы выявить и отслеживать новые заразные виды микробов и подтипы патогенов, которые спровоцировали предыдущие эпидемии.

Виды диагностики

Стандартный метод

Анализ полимеразно-цепной реакции проводится на основе многократной амплификации (удвоения) конкретного фрагмента ДНК и РНК при использовании особых ферментов-праймеров. В результате цепочки копирования получается количество материала, достаточное для исследования.

В ходе процедуры копируется только искомый фрагмент (соответствующий заданным конкретным условиям) и в случае, если он действительно присутствует в пробе.

О том, как проходит ПЦР, рассказывает это подробное видео с полезными схемами:

Другие методы

  • ПЦР , проводимая в режиме реального времени. В этом виде исследования процесс выявления заданного фрагмента ДНК запускается после прохождения каждого цикла, а не после осуществления всей цепочки 30 – 40 циклов. Этот вид исследования позволяет получить информацию о количестве патогена (вируса или микроба) в организме, то есть осуществлять количественный анализ.
  • ОТ-ПЦР (режим обратной транскрипции). Этот анализ используют, чтобы найти РНК с одной цепочкой для обнаружения вирусов, генетической базой которых является именно РНК (например, вирус гепатита С, иммунодефицита). При таком исследовании используется особый фермент — обратная транскриптаза и определенный праймер и на базе РНК строится одноцепочная ДНК. Затем из этой цепочки восстанавливают вторую цепь ДНК и выполняется стандартная процедура.

Показания для проведения

Процедура ПЦР применяется в клинике инфекционных болезней, неонатологии, акушерстве, педиатрии, урологии, гинекологии, венерологии, неврологии, нефрологии, офтальмологии.

Показания для назначения анализа:

  • выяснение риска развития генетических отклонений у ребенка при вероятности наследственных патологий;
  • диагностирование обоих родителей при планировании беременности или тяжелом состоянии матери при протекающей беременности;
  • трудности с зачатием, выявление причин бесплодия;
  • подозрение на половые инфекции в острой стадии и при симптоматике перехода их в хроническую;
  • обнаружение причин воспалительных процессов неясного происхождения;
  • незащищенные случайные и постоянные половые контакты;
  • определение чувствительности патогенного микроорганизма к конкретным антибиотикам;
  • пациентам с подозрением на скрытую инфекцию для обнаружения патогенов до развития явной симптоматики (доклиническое диагностирование);
  • больным для подтверждения выздоровления после болезни (ретроспективная диагностика);:

Также используется диагностика при необходимости точного выявления следующих возбудителей::

  • вирусы гепатита (A B C G), иммунодефицита человека, цитомегаловирус;
  • вибрион холерный;
  • вирус простого герпеса, герпетиформные виды;
  • ретро – адено – и риновирусы;
  • вирусы краснухи, Эпштейна-Барр, варицелла (Зостер – вирус);
  • парво – и пикорновирусы;
  • вирус папилломы;
  • онкогенные вирусы;
  • бактерия Helicobacter pylori;
  • легионеллы, патогенные типы палочки кишечной;
  • стафилококк золотистый;
  • возбудитель менингита;
  • клостридии, дифтерийная и гемофильная палочка;

Используется и для определения инфекций:

  • инфекционный мононуклеоз;
  • боррелиоз, листериоз, клещевой энцефалит;
  • кандидоз, вызываемый грибками Candida;
  • половые инфекции – трихомониаз, уреаплазмоз, бледная трепонема, гарднереллез, гонорея, микоплазмоз, хламидиоз;
  • туберкулез.

Противопоказания для проведения

Поскольку процедура проводится не с пациентом, без какого-либо воздействия на организм, а с биологическим материалом, взятым для исследования, то никаких противопоказаний для ПЦР не имеется по причине отсутствия потенциальной опасности.

Однако забор биоматериала из шеечного канала матки не проводят после процедуры кольпоскопии. Сдача мазков, соскобов на анализ разрешена только через 4 – 6 дней после окончания менструации и полного прекращения выделений.

Безопасен ли метод

Никакое негативное влияние на пациента при изолированном исследовании его биоматериала в лабораторных условиях невозможно.

Подготовка к процедуре (сдача биологических веществ на анализ)

В качестве образца для анализа ПЦР, при котором выявляют ДНК чужеродного патогена, служит любая биологическая жидкость, ткань, выделения организма. Забор исследуемого вещества проводят в виде взятия крови из вены, соскоба из гортани, полости носа, мочеиспускательного канала, плевральной полости, шейки матки.

Перед диагностической процедурой врач объясняет пациенту, забор какого материала будет взят:

  1. При обследовании на половые инфекции, производится забор выделений из половых органов, моча, мазок из уретры.
  2. При анализе на герпетические инфекции, цитомегаловирус, мононуклеоз – берут на анализ мочу, мазок из зева, на гепатит, токсоплазмоз — кровь из вены.
  3. С целью диагностирования различных видов поражений нервной системы проводится забор спинномозговой жидкости.
  4. В пульмонологии образцы для анализа — мокрота и жидкость плевральная.
  5. Когда проводят исследование возможных внутриутробных инфекций при вынашивании плода для анализа используют околоплодные воды и клетки плаценты.

Достоверность и точность анализа зависит от стерильности условий при взятии материала. Поскольку исследование ПЦР обладает высокой чувствительностью, любое загрязнение исследуемого вещества способно искажать результат.

Грамотная подготовка к сдаче биоматериала не представляет для пациентов никаких трудностей. Имеются определенные рекомендации:

  • при анализе на половые инфекции:
    • исключить интимные контакты за 72 часа до сдачи материала;
    • прекратить использование любых вагинальных средств за 3 суток;
    • с вечера предыдущего дня не проводить гигиену исследуемой области;
    • исключить мочеиспускание за 3 – 4 часа при взятии пробы из уретры;
  • прекратить прием антибиотиков за месяц до сдачи анализов на инфекции;
  • кровь сдают утром до принятия еды и питья;
  • сбор первой утренней порции мочи проводится в стерильный контейнер после тщательного интимного туалета.

О том, как проводится диагностика по методике полимеразной цепной реакции, читайте ниже.

Как проходит процедура

При выполнении исследования ПЦР раз за разом в реакторе (амплификаторе или термоциклере) повторяются определенные циклы:

  1. Первый шаг – денатурация. Слюну, кровь, биоптат, гинекологические пробы, мокроту, в которых подозревается присутствие ДНК (или РНК) патогена, помещают в амплификатор, где происходит нагревание материала и расщепление ДНК на две отдельные цепочки.
  2. Второй шаг – отжиг или небольшое охлаждение материала и добавление к нему праймеров, способных распознавать нужные участки в молекуле ДНК и связываться с ними.
  3. Третий шаг – элонгация – происходит после присоединения 2 праймеров к каждой из цепочек ДНК. В ходе процесса фрагмент ДНК патогена достраивается, и формируется его копия.

Эти циклы повторяются по типу «цепной реакции», каждый раз приводя к удвоению копий специфичного фрагмента ДНК (например, отрезка, где запрограммирован определенный вирус). За несколько часов образуется множество копий фрагмента ДНК, и выявляется их присутствие в образце. После этого проводят анализ и сравнение результатов с данными базы различных видов патогенов, чтобы определить вид инфекции.

Про расшифровку результатов и вывод исходя из ПЦР-реакции читайте ниже.

Расшифровка результатов

Окончательный результат исследования выдается через 1 – 2 суток после сдачи биологического материала. Нередко – уже в первые сутки после анализа.

Качественный анализ

  • Отрицательный результат означает, что в веществе, сданном на исследование, следов возбудителей инфекции не обнаружено.
  • Положительный результат означает выявление патогенных вирусов или бактерий в биологическом образце с очень высокой степенью точности на момент сдачи материала.

Если результат положительный, но признаков активизации инфекции не выявлено – такое состояние организма называют бессимптомным «здоровым носительством». Чаще всего наблюдается при взятии биоматериала из определенного места (цервикальный канал, уретра, полость рта) при вирусных заболеваниях. Лечения в этом случае не требуется, но обязательно постоянное врачебное наблюдение, поскольку существует вероятность:

  • распространения вируса от носителей и заражение здоровых людей;
  • активизации процесса и переход заболевания в хроническую форму.

Однако — если положительным является анализ крови, это указывает на то, что инфекция поразила организм, и это уже не состояние носительства, а патология, требующая незамедлительной специфической терапии.

Количественный анализ

Количественный результат определяет специалист конкретно для определенного вида инфекции. На его основании можно оценить степень развития, стадию болезни, что дает возможность оперативно назначить правильное лечение.

Средняя стоимость

Цены на проведение полимеразной цепной реакции определяют: вид исследования, сложность идентификации возбудителя, трудность забора биологического материала, вид анализа (качественный или количественный), уровень цен в лаборатории.

С другой стороны, при исследовании ПЦР можно определить сразу несколько патогенов при заборе одного вида материала для анализа. Это позволяет сэкономить на других лабораторных анализах.

Ориентировочно, стоимость анализа ПЦР в рублях:

  • гонококк, гарднерелла, трихомонада вагиналис – от 180
  • хламидия трахоматис – от 190
  • папилломавирус – от 380 до 500
  • биоценоз урогенитального тракта у женщин (количественная и качественная оценка микрофлоры) – от 800.

Еще больше полезной информации в отношении исследования ПЦР содержится в видеосюжете ниже:

Оцените статью:
(Пока оценок нет)
Загрузка...

Понравилась статья? Поделитесь с друзьями в социальных сетях:

Facebook

Вконтакте

Одноклассники

Google+


И подписывайтесь на обновления сайта в Контакте, Одноклассниках, Facebook, Google Plus, Twitter или по RSS.
Источник: http://gidmed.com/kardiologiya/diagnostika-kard/polimeraznaya-tsepnaya-reaktsiya.html
Интересное