Категории

Праймер репликация

Репликация ДНК

Репликация ДНК: праймер

Праймер — короткий фрагмент нуклеиновой кислоты или связана молекула, служит исходным пунктом репликации ДНК. Праймер нужен потому, что ни одна ДНК-полимераза (фермент, который катализирует репликацию ДНК) не может начать синтез новой молекулы ДНК с одноцепочечной матрице, поскольку нужна двухцепочечная участок для присоединения к ДНК, а также они способны только присоединять нуклеотид к уже имеющейся — ОН группы на 3 'конце другого нуклеотида.

Репликация ДНК

В естественной репликации ДНК, в качестве праймеров используются короткие цепочки РНК длиной около 12 нуклеотидов, синтезируются ферментомпраймазою. Праймазой может присоединять как рибонулеотиды, так и дезоксирибонуклеотидов, но синтезирует именно фрагмент РНК, поскольку рибонуклеотидов в ядре больше. Эти молекулы РНК позже изымаются и заменяются на ДНК ДНК-полимеразы.

Искусственные праймеры

Многие лабораторных методов биохимии и молекулярной биологии, привлекают использования ДНК-полимеразы, например секвенирования ДНК и полимеразная цепная реакция (ПЦР), требуют праймеров. Праймеры, используемые в этих методах, обычно короткие, химически синтезированные молекулы ДНК длиной 20-30 оснований.

Для ПЦР используют 2 праймеры, которые ограничивают с двух сторон последовательность, размножается. Для повышения специфичности реакции выбирают праймеры длиной 20-30 нуклеотидов, с содержанием Г-Ц пар около 50-60%. Г-Ц пары соединены между собой тремя водородными связями, поэтому они гарантируют лучший и более выборочный связь между праймером и матрицей. Для того, чтобы последовательность праймеров была уникальная и связывалась только с одной матрицей в смеси разных молекул ДНК (например, смесь всех ДНК человека), существуют специальные программы, которые с помощью баз последовательностей ДНК подбирают нужную последовательность нуклеотидов праймера.

Для клонирования последовательностей ДНК часто в последовательности праймеров вводят дополнительные нуклеотиды — сайты рестрикции, по которым режут ферменты рестриктазы. После приумножение нужного участка ДНК в ПЦР, полученные молекулы смешивают с ферментом, который разрезает их, образуя на концах так называемые «липкие концы». Такие конце позволяют легко вставить продукт ПЦР к искусственному ДНК-вектора.

Источник: http://info-farm.ru/alphabet_index/p/prajjmer-molekulyarnaya-biologiya.html

55. Репликативный комплекс (хеликаза, топоизомераза). Праймеры и их роль в репликации.

Репликация ДНК: праймер


Предыдущая123456789Следующая



 

Одно из наиболее волнующих предвидений вытекающих из модели двойной спирали ДНК, предложенной Уотсоном и Криком, заключалось в выдвижении гипотезы о принципе репликации ДНК. Поскольку структура двойной спирали ДНК определяется комплементарным спариванием оснований, было бы логичным предположить существование ферментов впоследствии названных ДНК-полимеразами, которые, двигаясь по одиночной цепи ДНК и узнавая в ней основания, встраивали бы в соответствии с правилом комплементарности соответствующие нуклеотиды в растущую дочернюю цепь. Можно было также предположить, что для синтеза ДНК вполне достаточно участия только одного единственного фермента. В действительности процесс репликации ДНК в эукариотических клетках зависит от функционирования чрезвычайно сложно устроенной макромолекулярной «машины».

Перед тем, как перейти к рассмотрению механизма репликации ДНК у эукариот и ее регуляции необходимо ввести некоторую терминологию, описывающую геометрию реплицирующейся ДНК. Точное место в хромосомной ДНК, с которого начинается процесс репликации этой информационной молекулы, получило название точки начала двунаправленной репликации. Термин «двунаправленная» подразумевает существование двух белковых ансамблей аппарата репликации ДНК движущихся в противоположных направлениях от точки начала репликации. Каждый «ансамбль» репликативного аппарата вместе с ДНК, которая реплицируется, получил название репликативной вилки из-за того, что в месте репликации молекула материнской ДНК разделяется на две отдельные цепи.

 

В отличие от прокариот до настоящего времени так и не известно, движутся ли репликативные вилки при удвоении ДНК эукариот вдоль данной молекулы наподобие движения «трамвая» по «рельсам» или же репликативная «машина» расположена в фиксированном месте клетки (наподобие «фабрики» репликации E. coli) через которую протягивается ДНК для последующего удвоения.

Природа двунаправленной репликации ДНК ставит фундаментальную проблему процесса удвоения этой молекулы, поскольку во всех известных случаях синтез дезоксиполинуклеотидов происходит только в направлении 5/®3/. В этой основополагающей полимеразной реакции активированная трифосфатная группа в 5/-положении приходящего дезоксинуклеозидтрифосфата образует фосфодиэфирную связь с ОН-группой в 3/-положении остатка дезоксирибозы концевого нуклеотида растущей дочерней цепи ДНК. Репликация одной, так называемой лидирующей (или непрерывной) цепи, не составляет никаких проблем поскольку образование дочерней цепи ДНК происходит в направлении 5/®3/. Однако синтез другой дочерней цепи ДНК в силу антипараллельности цепей исходной (материнской) двухцепочечной ДНК должен обеспечиваться участием ДНК-полимеразы, способной синтезировать дезоксиполинуклеотидные цепи в противоположном направлении, т.е. в направлении 3/®5/. Многочисленные попытки обнаружить ДНК-полимеразу с 3/®5/-полимеразной активностью оказались безрезультатными. Вместо этого было установлено, что вторая – отстающая цепь синтезируется в виде целой серии коротких фрагментов. При этом каждый раз комплекс полимераза/праймаза (см. далее) инициирует синтез отстающей цепи ДНК путем создания РНК-праймеров. Затем полимераза синтезирует собственно фрагменты ДНК, размером 250 нуклеотидов или около того, и сама полимераза движется в противоположном по отношению к точке начала репликации направлении, соблюдая правильную полярность 5/®3/. Таким образом, синтез отстающей цепи ДНК происходит в направлении, противоположном движению репликативной вилки в целом. Синтез каждого фрагмента отстающей цепи приостанавливается, когда ДНК-полимераза достигает 5/-конца предыдущего фрагмента. Из сказанного следует, что отстающая цепь копируется дискретно с образованием фрагментов, получивших название фрагментов Оказаки. Ферменты, принимающие участие в репликации ДНК и основные события, происходящие в области репликативной вилки, рассматриваются более детально в последующих разделах.

 


Предыдущая123456789Следующая

Источник: http://mylektsii.ru/2-95424.html

Репликация ДНК: учебное пособие (И. М. Спивак, 2011)

55. Репликативный комплекс (хеликаза, топоизомераза). Праймеры и их роль в репликации.

A) ДНК -раскручивающие белки:

  • DNA-A (вызывает расхождение нитей)

  • ХЕЛИКАЗЫ (расщепляют цепь ДНК)

  • ТОПОИЗОМЕРАЗЫ 1 и 2 (раскручивают свер спирали). Разрывают (3',5')-фосфодиэфирные связи.

B) Белки, препятствующие соединению нитей ДНК (SSB -белки)

C) ДНК-ПОЛИМЕРАЗА (катализирует образование фосфодиэфирных связей). ДНК- ПОЛИМЕРАЗА только удлиняет уже существующую нить, но не может соединить два свободных НУКЛЕОТИДА.

D) ПРАЙМАЗА (катализирует образование «затравки» к синтезу).

Е)ДНК-ЛИГАЗА.

5. ПРАЙМЕРЫ - «затравка» для репликации. Это короткий фрагмент, состоящий из РИБОНУКЛЕОТИДТРИФОСФАТОВ (2 - 10). Образование ПРАИМЕРОВ катализируется ПРАЙМАЗОЙ. Действуют ферменты (ТОПОИЗОМЕРАЗЫ), вызывающие раскручивание сверх спирали. SSB-белки препятствуют соединению дочерних цепей. Образуется РЕПЛИКАТИВНАЯ ВИЛКА. Образование дочерних нитей. Этому предшествует образование ПРАИМЕРОВ с помощью фермента ПРАЙМАЗЫ. Действует ДНК-ПОЛИМЕРАЗА и образуется дочерняя нить ДНК. Этот процесс происходит в соответствии с принципом комплиментарности, и синтез идёт от 5' к 3' концу синтезируемой нити.

На одной из материнских нитей будет строиться непрерывная цепь, а на противоположной нити - цепь из коротких фрагментов (фрагментов ОКАЗАКИ) Удаление ПРАИМЕРОВ с помощью ЭКЗОНУКЛЕАЗЫ.

44. Биосинтез рнк (транскрипция). Условия и этапы транскрипции. Процессинг рнк. Альтернативный сплайсинг

Транскрипция - передача информации с ДНК на РНК (биосинтез РНК). Транскрипции подвергаются только определённые части молекулы ДНК. Эта часть называется ТРАНСКРИПТОНОМ. ДНК эукариот прерывистая: участки, несущие информацию (ЭКЗОНЫ), чередуются с участками, не несущими информацию (ИНТРОНЫ). В ДНК с 5'-конца выделяют ПРОМОТОРНУЮ область - место присоединения РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ. С 3'-конца - ТЕРМИНАТОРНАЯ зона. Эти области не транскрибируются. УСЛОВИЯ ТРАНСКРИПЦИИ.

1. Матрица - 1 нить ДНК. Образуется транскрипционный глазок.

2. Структурные компоненты - РИБОНУКЛЕОЗИД-3-ФОСФАТЫ (АТФ, ГТФ, ЦТФ, УТФ).

3. ДНК-зависимая РНК-ПОЛИМЕРАЗА.

ОСНОВНЫЕ ЭТАПЫ ТРАНСКРИПЦИИ.

1. ИНИЦИАЦИЯ. Заключается в присоединении РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ к ПРОМОТОРУ, что приводит к расхождению нитей ДНК. Импульсом к присоединению РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ является присоединение ТВР-белка к TATA-боксу.

2. ЭЛОНГАЦИЯ (удлинение). Соединение РИБОНУКЛЕОЗИДМОНОНУКЛЕОТИДОВ и образование фосфодиэфирных связей между НУКЛЕОТИДАМИ с помощью РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ, которая передвигается вдоль нити ДНК. Присоединение НУКЛЕТИДОВ идет в соответствии с принципом комплиментарности, только будут РИБОНУКЛЕОТИДЫ и - УМФ.

3. ТЕРМИНАЦИЯ (окончание).Заключается в том, что со стороны 3'-конца образованной РНК присоединяется множество (до 200 - 300) АДЕНИЛОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ - поли А. Образуется точная копия гена. АДЕНИЛОВЫЕ НУКЛЕОТИДЫ защищают 3'-конец от действия ЭКЗОНУКЛЕАЗ. С 5'-конца образуется защита, так называемый «САР» (чаще всего УДФ). Эта образовавшаяся копия гена называется ТРАНСКРИПТ.

4. ПРОЦЕССИНГ (созревание).

  • Кепирование 5-конца

  • Формирование полиадениловой последовательности

  • СПЛАЙСИНГ - удаление интронов и соединение ЭКЗОНОВ между собой. Играет важную роль в эволюции организмов,

  • Альтернативный СПЛАЙСИНГ- из одной пре-иРНК образуется несколько ИРНК и соответственно несколько белков, что проявляется в разнообразии признаков у организмов.

Источник: https://StudFiles.net/preview/5246024/page:17/
Возможно вас заинтересует: